: تثبیت نیتروژن

چرخه ازت

       ازت از عناصر بسیار مهم تشکیل دهنده پروتئین هایی است که برای ادامه حیات میکروارگانیسمها مورد نیاز می باشد. نظر به اینکه ازت، در منابع آب به مقدار محدودی می باشد، به عنوان عامل محدود کننده زندگی گیاهان میکروسکوپی آبزی مؤثر است.

       در چرخه ازت، فرآیندهای اکسیداسیون و احیا دخالت مستقیم دارند و مقدار اکسیژن محلول در آب، تعیین می کند که چرخه به سمت کدام فرآیند میل می کند. بدین ترتیب تکامل موجودات زنده در آبهای پذیرنده تحت تأثیر قرار می گیرد.

      اگر چه 78 درصد اتمسفر را مولکول ازت تشکیل می دهد اما، این گاز فقط برای تعداد محدودی از میکروارگانیسمها قابل استفاده است. بقیه میکروارگانیسمهای ازت زا به صورت ترکیبات نیترات()، آمونیوم() یا اسید جذب می کنند. این جانداران قسمت اعظم ترکیبات ازت را به اسید نوکلئیک و پروتئین های مورد نیاز سلول خود تبدیل می کنند.

    مواد دفعی حاصل از فرآیند سوخت و ساز حاوی ازت و موجودات مرده، توسط میکروارگانیسمها تجزیه می شوند.

چرخه ازت را می توان به 4 بخش اصلی تقسیم نمود:

1-   تثبیت ازت هوا،

2-   آمونیفیکاسیون،

3-   نیتروفیکاسیون،

4-   دنیتریفیکاسیون.

تثبیت ازت هوا

     اگر چه تنها انواع محدودی از میکروارگانیسمها قادر به جذب ازت هوا هستند، ولی این فرآیند در کنار فرآیند فتوسنتز، مهمترین فرآیندهای تولید مواد آلی است.

از گروه جلبکهای سبز آبی، انواع Nostoc، Anabena و Phormidium قادر به جذب ازت  هوا می باشند.

باکتریهای زیر در آب قادر به جذب ازت می باشند:

هوازی: دسته Azotobacter از جمله Azotob.agile و Azotob.chroococcum .

هوازی اختیاری: Klebsiella pneumoniae و Beijerinckia و Bacillus Polymyxa .

بی هوازی: انواع Clostridium (اغلب در لجن رسوبات).

در دریای سیاه: نوعی از Spirillum .

    میکروارگانیسمها به کمک آنزیم Nitrogenase قادر به جذب ازت بوده و برای تشکیل آن یونهای آهن و مولیبدن مورد نیاز است. در رابطه با E.coli که معمولاً اسیدهای آمینه خود را از  تأمین می کند به طور تجربی از Klebsiella peneumoniae ماده کنترل کننده تولید نیتروژناز که nif-Operon نام دارد، به دست می آورد.

    بدین ترتیب E.coli قابلیت جذب ازت را پیدا می کند. فرمول عمومی جمعی مربوطه براساس نظریه های Lehninger به ترتیب زیر است:

نیتریفیکاسیون

     در حضور اکسیژن،  آمونیاک() به نیتریت() و سپس به نیترات() را نیتریفیکاسیون می نامند. باکتریهای نیتریت، انواع Nitrosomonas، آمونیوم را به نیتریت اکسید می کنند:

      باکتریهای نیترات Nitrobacter که همراه باکتریهای نیتریت در محیط زندگی می کنند، ترکیب سمّی نیتریت را به نیترات اکسید می کنند.

    در آب رودخانه هایی که در آنها فاضلاب تخلیه می شود، همواره باکتریهای نیتریفایر موجود می باشند.

    برای این گونه باکتریها، همانطور که جهت سوخت و ساز سلولی، آمونیوم و اکسیژن مهم است، تأثیر درجه حرارت و pH نیز بسیار پر اهمیت می باشد.

تجزیه نمک های آمونیوم به در پارامتر بالا بستگی داشته و دارای فرمول عمومی زیر است:آ

شکل4-3- چرخه ازت در تصفیه فاضلاب

     با افزایش مقدار pH، بر غلظت  افزوده شده و بدین ترتیب سمّی بودن محیط نیز افزایش می یابد. بی کربنات کلسیم نقش یک بافر را بر عهده دارد.

     نوسانات درجه حرارت باعث ایجاد عدم تعادل می شود. هر دو نوع باکتری نیتریت و نیترات با افزایش درجه حرارت سوخت و ساز سلولی بیشتری دارند ولی باکتریهای نیتریت به کاهش دما حساسیت بیشتری نشان می دهند. در مقابل، باکتری نیترات نسبت به مقدار غذای موجود در محیط و غلظت اکسیژن محلول و وجود مواد سمّی حساس ترند. بنابراین در آبهای ساکن ممکن است غلظت ترکیب سمّی نیتریت افزایش می یابد. در کنار آمونیوم، نیترات نیز جزو مواد مغذی مهمی است که مورد نیاز گیاهان می باشد.

    ورود آمونیاک به آب های سطحی، باعث افزایش مصرف اکسیژن می شود. آمونیاک در غلظت های زیاد برای آبزیان خطرناک است و به همین دلیل است که فرآیندهای تصفیه بیولوژیک با هدف ایجاد ترکیبات نیتراته انجام می شود. نیتروزوموناس و نیتروباکتر، رشد آهسته ای داشته، میله ای شکل و گاه کوکوئید، گرم منفی، هوازی اجباری و کیمولیتوتروف می باشند. جدا کردن این باکتری ها دشوار است.

غنی کردن نیتروزوموناس

محیط معدنی با ترکیبات خاص، برای غنی کردن نیتروزوموناس مناسب است. ترکیبات این محیط به قرار زیر است:

غنی کردن نیتروباکتر

محیط معدنی با این ترکیبات، رشد نیتروباکتر را فراهم می آورد:

شیوه انجام کار

     در یک ارلن cc50، از محیط های نام برده تهیه کرده و 5/0 تا 1 گرم خاک باغچه به آن اضافه می کنیم. بعد در دمای 30 درجه سانتیگراد در شیکر قرار می دهیم. معمولاً در مدت 3 تا 5 هفته، باکتری های نیتریفایر رشد می کنند. از محیط های کشت، پس از تهیه لام و رنگ آمیزی، بررسی میکروسکوپی به عمل آورده و از انواع مختلف شکل کشیدیم. این باکتری ها، به صورت میله های کوتاه یا کوکوس می باشند که به طور معمول به صورت دسته جمعی در زیر میکروسکوپ دیده می شوند. هر هفته یک بار، ارلن ها را برای بررسی نیتریت و نیترات آزمایش کردیم. با پیپت استریل، چند قطره از محیط کشت را در چاهک های لام شیشه ای وارد نموده یک قطره معرف نسلر به آن افزودیم. (در صورت وجود آمونیاک، رنگ زرد طلایی در محیط ظاهر خواهد شد) بعد به هر کدام از آنها به صورت جداگانه یک قطره نفتیل آمین و یک قطره دی نفتیل آمین اضافه کردیم. (که در صورت وجود نیتریت معرف نفتیل آمین محیط کشت را قرمز و همچنین در صورت وجود نیترات معرف دی نفتیل آمین محیط کشت را آبی می کند.) نتایج حاصل از آزمایش در جدول زیر آورده شده است.

                          رشد ازتو باکتر روی محیط کشت

فعالیت نیتروزوموناس

فعالیت نیترو باکتر